研究内容

応用生物プロセス学講座 > 研究内容 > 不斉還元バイオ触媒を用いる高効率な光学活性アルコール生産法の開発

不斉還元バイオ触媒を用いる高効率な光学活性アルコール生産法の開発

Production of optically pure alcohols with an asymmetric hydrogen-transfer biocatalysis: application of engineered enzymes in polar organic solvent-water media

Asymmetric reduction of ketones is a suitable method to obtain optically pure alcohols for pharmaceuticals and agrochemicals. A BINAP-Ru and its derivatives are well known organometallic catalysts for this purpose, and excellent performances have been demonstrated 1). However, several advantages of bio-based methods using enzymes or whole-cells systems compared with a BINAP process have been recognized in industry from the viewpoint of the cost of catalyst preparation, handling and green chemistry.

We have developed an efficient method producing optically pure alcohols by asymmetric hydrogen-transfer bioreduction of ketones in 2-propanol (IPA) and water media with phenylacetaldehyde reducatse (PAR) from Rhodococcus sp. ST-10 2) and alcohol dehydrogenase from Leifsonia sp. S749 (LSADH) 3,4), which are able not only to reduce the targeted ketones but also to reproduce NADH from NAD+ using IPA (Fig.1a).

To improve the conversion efficiency in high concentration of substrate and IPA, PAR mutant enzymes were engineered. PAR variant, Sar268/HAR1 (A3S, I4L, E12G, D42L, K67R, L125M, S173P, A327V) 5), was able to operate in relatively high concentration of IPA (>20% (v/v)) to achieve efficient conversion of concentrated substrate without altering the stereoselectivities. These mutation sites scattered on the protein surface and were distant from the active site of the enzyme. In addition, it was also confirmed that immobilization of E. coli biocatalyst with glutaraldehyde (GA) and polyethyleneimine (PEI) increased the stability of this biocatalyst during operation (Fig. 1b) 6). Enzyme catalysis in such media system would be very important to convert various organic compounds insoluble in water for biotechnology and bio-based green chemistry.

Fig.1  a) Reaction in 2-propanol (IPA)-water media, and b) Photo of immobilized E. coli biocatalyst with GA and PEI (SEM).
Fig.1 a) Reaction in 2-propanol (IPA)-water media, and b) Photo of immobilized E. coli biocatalyst with GA and PEI (SEM).

References

  1. Y. Noyori and T. Ohkuma, Asymmetric catalysis by architectural and functional molecular engineering: practical chemo- and stereoselctive hydrogenation of ketones. Angew. Chem. Int. Eng., 40, 40-73 (2001).
  2. N. Itoh et al.: Chiral alcohol production by NADH-dependent phenylacetaldehyde reductase coupled with in situ regeneration of NADH. Eur. J. Biochem., 269, 2394-2402 (2002).
  3. K. Inoue et al.: Production of (R)-chiral alcohols by a hydrogen-transfer bioreduction with NAD+-dependent Leifsonia ADH (LSADH). Tetrahedron: Asymmetry, 16, 2593-2594 (2005).
  4. K. Inoue et al.: Gene cloning and expression of Leifsonia alcohol dehydrogenase (LSADH) involved in asymmetric hydrogen-transfer bioreduction. Biosci. Biotechnol. Biochem., 70, 418-426 (2006).
  5. Y. Makino et al.: Engineering the phenylacetaldehyde reductase mutant for improved substrate conversion in the presence of concentrated 2-propanol. Appl. Microbiol. Biotechnol., 77, 833-843 (2007).
  6. N. Itoh et al.:Continuous production of chiral 1,3-butanediol using immobilized biocatalysts in a packed bed reactor: promising biocatalysis method with an asymmetric hydrogen-transfer bioreduction. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75, 1249-1256 (2007).

スチレン資化性菌Rhodococcus sp. ST-10(旧Corynebacterium)由来のフェニルアセトアルデヒド還元酵素(PAR)とLeifsonia sp. S749由来アルコール脱水素酵素(LSADH)をE. coliで発現し、同菌体反応により、両酵素の有する2-プロパノール脱水素酵素活性を補酵素の再生系に用いて、目的のケトンから100%に近い収率で高濃度にS、Rの両光学異性体アルコール(100-350g/L以上、96->99% e.e.)を生産するバイオプロセスを開発し、現在、住友化学株式会社等と共同で工業プロセスとしての確立を目指している。本法は、安価な2-プロパノールからNADHを経由して水素をケトンに移動し目的の光学活性アルコールを合成する水素移動型の非常に実用的なバイオプロセスである。その優れた点は、

  1. 1種類の酵素が目的ケトンの立体選択的な還元と補酵素NADHの再生を同時に行うこと
  2. PAR/LSADHともに比較的安価で安定なNADH依存性であること
  3. PAR/LSADHともに、少なくとも産業的に重要な40種類以上のケトンに作用し汎用性が高くかつ立体選択性も極めて高いこと(PARはS-選択性、LSADHはR-選択性 図1)
  4. 2-プロパノールが水素源のみならず基質ケトン類の溶解度を上げる両媒性の試薬として機能し、水系反応が高速で進行すること
  5. ほとんどの場合、高濃度基質(10%以上程度)を100%収率で目的の光学活性体に変換できる高効率反応であること

等である。

既に、BINAPを始めとする金属化学触媒(不斉ルテニウム/ロジウム錯体触媒)を用いたテルペノイドやケトン類の不斉還元法が開発され、2001年度のノーベル化学賞の受賞対象となっている。本プロセスは、

  1. 多くの場合、BINAP系不斉金属触媒以上の光学純度を示す
  2. 触媒の調製が容易でハンドリングにも優れている
  3. ルテニウムやロジウムなどの貴金属を使用せず再生可能な酵素触媒を利用している
  4. 常温・常圧の反応であり省エネルギーかつ安全性が高い等、グリーンケミストリーの観点からはBINAP系金属触媒よりも優れた特性を有している

現在、生産性なども考慮すると世界で最も優れたケトン類の不斉還元法であり、酵素触媒のライブラリー化が進展すれば、その汎用性は一層高くなるものと期待できる。

その他研究のテーマの説明

▲このページの先頭へ