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UDP-グルクロン酸転移酵素関連テーマ

UDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)は、主に肝臓小胞体に局在する膜酵素であり、生体内外の異物(薬物や環境汚染物質、食品添加物など)である脂溶性化合物にグルクロン酸を転移するグルクロン酸抱合を触媒する。ヒトにおいては食品成分(フラボノイドなど)は薬物と同様にグルクロン酸抱合をうけることから、近年、食品中の機能性成分の効能発現にはシトクロムP450と共にUDP-グルクロン酸転移酵素が重要な役割を果たすことが明らかになってきた。機能性食品工学部門におけるUDP-グルクロン酸転移酵素関連テーマの概要を以下に示す。

1. UDP-グルクロン酸転移酵素の構造と機能に関する研究

(i) UDP-グルクロン酸転移酵素特異的抗体による発現解析
ヒトUGT1分子種に対する特異的ペプチド抗体

UDP-グルクロン酸転移酵素は遺伝子ファミリーを形成しており、基質特異性の異なる複数のアイソザイムが存在する。とくにUGT1遺伝子ファミリーに属するアイソザイムはアミノ酸配列上での相同性が高く精製酵素を免疫源とした方法では特異的な抗体を得ることが困難である。そこでアイソザイムに特異的なアミノ酸領域の合成ペプチドに対する抗体を作成し、UGT1タンパク発現の解析をおこなった。その結果、種々の薬物(酵素誘導剤)や発達過程において各アイソザイムが異なる発現調節を受けることを明らかにし、遺伝子レベルでの発現制御機構の解明の出発点となった。このラットUGT分子種に対する特異的抗体を用いた共同研究により、ラット雌周産期におけるプロラクチン依存的なUGT発現の周期変化やPCB誘導体による分子種特異的な発現誘導を明らかにした。これらラット分子種での抗体作成技術をもとにヒトUGT分子種に対する複数のペプチド抗体の作成に成功しており、今後ヒトにおけるUGT発現解析においてその有用性は高まるものと思われる。

(ii) 異物抱合の多様性を生み出すUGT間の相互作用の解析

異物代謝において重要であるグルクロン酸抱合化の酵素レベルでの活性調節機構の解析をおこなっている。特異的抗体を結合させた樹脂カラムを用いてUDP-グルクロン酸転移酵素アイソザイム間(UGT1とUGT2B1)の相互作用を直接的に示した。ラット及びヒトUGT分子種の酵母発現系を用いて分子間相互作用の証明をおこない、キメラタンパクでの相互作用解析よりヘテロ分子種間における複合体形成にはC末端後半領域が関与していることを示した。さらにアイソザイム間での複合体形成がグルクロン酸抱合化の活性制御に関与することを示し、小胞体膜上でのUGTタンパク質相互作用が食品成分を含めた異物代謝における基質多様性(特異性)を生み出す可能性を示した。

2. 異物代謝酵素群による食品中機能性成分の代謝解析

(i) UDP-グルクロン酸転移酵素分子種発現系による抱合代謝解析
酵母発現UGTによるケルセチン部位特異的抱合反応

UDP-グルクロン酸転移酵素は外界からの低分子化合物の防御機構として進化してきた解毒代謝酵素である。自然界では植物等が産生する2次代謝産物であるフラボノイドやアルカロイドなどの生体毒性をもつ化合物の解毒代謝をおこなうため進化してきたと思われる。近年では環境中に放出される種々の環境汚染物質の解毒代謝に関与することが示唆されてきた。これまで我々は特異抗体及び発現系を用いた解析により種々のUGT分子種が環境汚染物質の抱合化に関与することを明らかにした。ラット肝臓におけるビスフェノールAの抱合化には主にUGT2B1分子種が関与することを酵母発現系及び抗体阻害による実験より明らかにした。また、ダイオキシン代謝物の抱合化にはヒト肝臓のUGT分子種であるUGT1A1,1A9及び2B7が関与することを示した。さらに、ヒト、ラット、マウス肝臓、小腸で発現している主要な分子種をクローニングし酵母あるいは動物細胞を用いた分子種発現系を構築しており、さまざまな基質の抱合化に関与する分子種の同定に用いている。

(ii) 異物代謝発現酵母株を用いた代謝物調製技術の開発

生体内でつくられる代謝物の合成方法には、まず有機合成法があげられるが、開発初期における多様な化合物の網羅的な合成には困難なことが多い。また、実験動物に医薬品を投与して胆汁や尿から単離する方法があるが、数十mg程度はつくることができても、安全性確認には必要なグラム単位での製造には対応できない。そこで低コストでかつ簡便に大量の代謝物を調製する技術が望まれてきた。

組換え酵母菌体を用いたグルクロン酸抱合体の調整

1985年、榊らは出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeを宿主として薬物代謝に関与するP450電子伝達系を発現させることに成功し、ヒト由来P450分子種発現酵母を用いて様々な医薬品の代謝物を調製することが可能となった。さらに生城らはもう一つの薬物代謝酵素であるUGTを酵母にP450と同時に発現させることにより医薬品の連続的な代謝反応(水酸化及びグルクロン酸抱合)を再現した。これら発現系の細胞抽出液により代謝物の調製が可能となったが、グルクロン酸抱合反応には補基質として高価なUDP-グルクロン酸を添加しなければならず、代謝物調製に関してはコスト面の問題があった。そこで酵母内でのグルクロン酸抱合反応を可能にするために、酵母が本来持っていない酵素、UDP-グルコース脱水素酵素遺伝子を導入し、酵母の中でUDP-グルクロン酸が供給を可能な酵母株を作り出した。この酵母株を用いて菌体培養液に医薬品を添加することにより容易かつ大量に薬物代謝酵素による代謝産物を調製することに成功した。

また近年では食物から摂取したフラボノイドなどのポリフェノール類が異物として認識され、UGTによって非常に効率よく抱合体に変換された後、体外排泄されることが明らかにされてきた。さらに体内に残ったグルクロン酸抱合体を含むフラボノイド代謝物が炎症部位に蓄積し、脱抱合で産生されたアグリコンが局所的な作用を及ぼす可能性が示され、食品成分の機能性についても代謝物が重要な役割を担っている可能性が示唆されている。

以上のように、医薬品のみならず生体にとって異物と認識される化合物は薬物(異物)代謝酵素によって変換をうけて、生体にさまざまな影響を及ぼすことが明らかとなってきた。今後、酵母を含めた代謝酵素発現系を用いたヒト代謝物の調製技術はますます重要になるものと思われる。

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